新冠病毒測試背後的科學

香港科技大學化學系理學教育助理教授陳鈞傑教授

新型冠狀病毒肺炎全球大流行之際，香港疫情的再度爆發令我們憂心忡忡。新冠病毒測試能夠辨認出受感染的人士，有助盡早安排隔離和治療。因此，病毒測試對阻截病毒傳播至關重要。這篇文章將為大家介紹新冠病毒測試背後的科學。

在新冠病毒測試中，深喉唾液樣本會被送往實驗室進行檢測。而新冠病毒檢測應用到一個名為“單步逆轉錄—即時聚合酶鏈式反應”(One-step Reverse Transcription Quantitative Polymerase Chain Reaction，簡稱RT-qPCR)的技術。為更好地了解病毒測試的原理，這篇文章將為大家逐步剖析。

1. 逆轉錄---把病毒基因密碼翻譯成DNA

眾所周知，我們的遺傳密碼都記錄在DNA (deoxyribonucleic acid, 脫氧核糖核酸)中，而DNA “密碼”則由四個“字母”---- “A”, “T”, “C”和 “G”排列而成。在化學上，A、T、C、G 屬於一類名為 “鹼基”的化學物，而DNA則是由它們組成的聚合物。A、T、C、G不同的排列對應著不同的氨基酸序列。由於我們身體裏的蛋白質由氨基酸組成，A、T、C、G不同的排列控制了我們身體裏蛋白質的製造，也控制了我們身體的運作。

當我們的身體製造蛋白質時，它會先把DNA密碼進行翻譯。一般而言，我們的細胞會把DNA翻譯RNA(ribonucleic acid, 核糖核酸)。因為這個以RNA 寫成的翻譯版本會被用作傳達基因信息，所以它被稱為 “信使RNA”(messenger RNA, mRNA)。這個由DNA翻譯成mRNA 的過程稱為轉錄 (transcription)。

核糖核酸病毒 (RNA virus) 的基因密碼記錄在RNA，而不是DNA。有些RNA病毒能直接將它們的RNA基因在人類細胞中當作mRNA入侵我們的細胞 （例如新冠病毒），亦有些RNA病毒 (例如愛滋病病毒) 會先將它們的RNA遺傳基因密碼翻譯成DNA的格式，這樣病毒就可以把它們的基因插入我們的基因之中，偽裝為我們自身的基因。

病毒這樣做的最終目的就是利用我們的細胞去複製自身。病毒把RNA記錄的遺傳密碼轉換為DNA的過程與轉錄恰恰相反，所以它被稱為逆轉錄 (reverse transcription)。核糖核酸病毒有一種名為逆轉錄酶(reverse transcriptase)的酵素，以加快逆轉錄的速度。而逆轉錄所得的DNA因為與病毒的RNA相互對應，所以被稱為互補DNA(complementary DNA, cDNA)。因為互補DNA記錄了病毒的基因密碼，所以它將會對往後的步驟十分重要。

2. 聚合酶鏈式反應

聚合酶鏈式反應能夠把一段DNA 序列複製數以百萬次。這令科學家能夠取得足夠的DNA樣本來進行測試。例如在新冠病毒測試中，聚合酶鏈式反應有助取得足夠份量的DNA，以證實當中是否有病毒的基因序列。

聚合酶鏈式反應是一個化學反應，而它需要下列材料:

• 測試者的DNA 樣本 (作為複製的模板)
• 一種耐熱的DNA聚合酶 （作為一種能複製DNA 的酵素）
• 一對名為引物的DNA序列 (用作標記複製的範圍)
• 鹼基 (DNA 的組成部分)
• 鎂鹽 (因為DNA聚合酶需要鎂離子才能正常運作)
• 緩衝溶液 (把酸鹼值維持在一個適當水平)

以上材料在塑料管混合以後，會被放在溫度循環器中。在溫度循環器中，温度會在95度 (3 秒) 和55度(30秒) 之間來回循環。

在95度中，DNA 的雙鏈結構會被打開，變為各自一段單鏈。這一步稱為變性。

然後，温度下降至55度。一對對應新冠病毒基因的引物會嘗試尋找新冠病毒的基因序列。如果測試者帶有新冠病毒，這對引物就會找到相應的序列。這一步名為退火。一旦引物找到屬於病毒的基因序列，DNA 聚合酶就會開始複製病毒留下的基因序列。這一步稱為延長。在這一步之後，我們便成功把DNA複製了一遍。

在下一個温度循環時，温度回升至95度。在那時，延長會停止。而DNA的雙鏈結構會再被打開。然後所有步驟再重複一次。

如此類推，DNA的份量在每次循環中會增加兩倍。在45個循環後，我們所獲得的DNA是原來的245 倍。

上列圖表展示了病毒篩查背後所涉及的化學反應。另外注意UNG 處理這一步的目的在於減少不同測試樣本之間的交叉污染。(美國疾病控制與預防中心 --- 病毒檢測指南)

3. 即時聚合酶鏈式反應 / 定量即時聚合酶鏈式反應

聚合酶鏈式反應對測試人員構成不便的主因是，在這類常用的方法中，科學家必須要等候完成所有循環才能進行最終測試並得知結果。於是，科學家加以改良，令他們能夠實時監察測試的進度。經改良後的方法稱為即時聚合酶鏈式反應或定量即時聚合酶鏈式反應。在這個新方法中，科學家把原來的引物換成了DNA 探針，而DNA 探針的功能亦是尋找測試樣本中的病毒基因。DNA 探針有兩種特徵: 它的一端帶有熒光染料，而另一端則帶有熒光淬滅劑。當DNA 探針同時帶有熒光染料和熒光淬滅劑，熒光淬滅劑會阻止熒光染料發光。

*在新冠病毒測試中用到的前置引物、後置引物和DNA 探針 (美國疾病控制與預防中心 --- 病毒檢測指南)

在退火的那一步中，DNA 探針會在樣本的DNA中尋找對應的序列。而在其後的步驟中，DNA 聚合酶會到達DNA 探針所在的位置，並開始複製DNA。在那時，DNA 聚合酶會把DNA 探針上的熒光染料釋放出來。因此，熒光染料得以發光，而我們可以在紫外光下接收熒光訊號。我們便可以透過量度熒光訊號的強度，得知測試的進度。

*以上示意圖展示了DNA 探針的運作原理。藍色圓形 = 熒光染料; 紅色圓形 = 熒光淬滅劑; 黃色 = DNA 聚合酶

4. 單步逆轉錄—即時聚合酶鏈式反應

疑似患者的深喉唾液樣本有可能帶有新冠病毒，而單步逆轉錄—聚合酶鏈式反應可以有助我們確認誰是真正患者。

第一步是透過逆轉錄，將病毒的RNA轉換成相應的互補DNA序列。而互補DNA序列將會在下一步的聚合酶鏈式反應派上用場。

在傳統的做法中，我們需要透過逆轉錄取得互補DNA，然後對互補DNA進行聚合酶鏈式反應。這涉及兩個步驟，既繁複又費時。因此，科學家將工序改良，把原本需要兩步的反應簡化為一步。這樣把測試效率大大提高，而温度的調節可以控制逆轉錄和聚合酶鏈式反應的進度。

*單步與雙步逆轉錄—聚合酶鏈式反應之間的比較

如果熒光訊號的強度超過特定門檻，那個樣本即是對測試呈陽性反應。

*聚合酶鏈式反應所發出的熒光隨著循環次數增加的改變。紅綫標示著門檻的水平。(美國疾病控制與預防中心 --- 病毒檢測指南)

我們在文中介紹了美國疾病控制與預防中心的第一代檢測方法，現時科學界已經研發了一些靈敏度更優勝的新檢測試劑（例如：SYBR® Green探針）。

5. 對照實驗

新冠病毒測試的可靠性十分重要。畢竟沒有人會願意被錯誤為確診者（即假陽性）。另一方面，如果受感染的人被誤作陰性（即假陰性），這亦會對社會大眾構成風險。

上述的逆轉錄—聚合酶鏈式反應並非百分百準確，而當中的每一個步驟都有可能出錯。為防任何出錯，我們必須在新冠病毒測試之中加入一系列對照實驗。

測試的第一步是從病人身上取得核酸樣本。為了確認這一步是否妥善完成，測試劑中一般還會包括一個正常人的樣本以作對照。如果病人和正常人的樣本都對一個人類普遍擁有的基因 (核糖核酸酶P)呈陽性，這代表我們已經成功提取病人的核酸樣本。./p>

另外，測試劑中亦包括新冠病毒的核酸樣本，以作為陽性對照。這些來自新冠病毒的陽性對照必須被測出對新冠病毒呈陽性，以確保聚合酶鏈式反應沒有出錯。此外，整套測試亦會在沒有樣本的情況下進行，以作為陰性對照。在正常的情況下，陰性對照應該在所有測試都對新冠病毒呈陰性。

如果要肯定一個人確診新冠肺炎，那個人的樣本必須要對新冠病毒三段基因序列呈陽性反應。另外，所有對照實驗的結果都必須要與預期中的一致。

大家千萬不要忘記辛勤工作、為我們提供可靠檢測的化驗室人員! 筆者亦在此希望大家能夠對他們給予感謝和鼓勵! 如果你感到不適並出現新冠肺炎的病徵，哪怕病徵輕微，你亦應儘快到私家或公營診所安排檢測!